2 × Pfu-PCR-Miksaĵo

Ultra-pura altfidela Taq DNA-polimerazo.

Pfu DNA Polymerase estas esprimita de E. coli kun klonita Pyrococus Furiosis DNA Polymerase-geno kaj purigita kaj apartigita per plurkolona purigo. Ĉar Pfu havas 3′-5 ′ -eksonuclease-agadon, ĝi povas provlegi en DNA-plifortiga procezo, dum tradicia Taq DNA-Polimerazo ne povas. Kvankam aliaj Taq-DNA-polimerazoj kiel Vent, Deep Vent, Tli, UITma, ktp. Havas provlegajn funkciojn, Pfu havas la plej malaltan misagordan indicon inter ĉiuj Taq-DNA-polimerazoj trovitaj ĝis nun. Pfu DNA-Polimerazo havas pli bonan termikan stabilecon ol ofta Taq-DNA-polimerazo, kaj ĝi povas konservi pli ol 90% agadon je 95 ° C dum 1 horo.

Unutuba Pfu-PCR-Miksaĵo (Nacia Altteknologia Produkta Atestado)

■ La Pfu-PCR-Miksaĵo plibonigis specifecon kaj sentemon de PCR-reago kaj povas plifortigi kompleksajn ŝablonojn kun alta GC-enhavo, duaranga strukturo kaj similaj. Malpli ol 2 kopioj de la cela ŝablono povas esti plifortigitaj, certigante pli precizajn eksperimentajn rezultojn.

■ La unika formulo de Pfu MasterMix tre stabiligas la tutan reagan sistemon, kaj la agadon ne influos ripeta frosto-degelo aŭ longtempa stokado je 4 ° C.

■ La stabila kaj efika antaŭpreparita PCR-miksa solvo povas fari la operacion rapida kaj simpla, multe reduktante laboran intensecon kaj specimenan eraron. Altfunkcia PCR-plibonigilo kaj optimumigilo ankaŭ estas inkluzivitaj en la miksaĵo, kio malpliigas la postulojn pri PCR-kondiĉoj.

■ Ĉi tiu produkto havas ambaŭ tinkturajn kaj senkolorajn sistemojn. Tinkturfarbaj PCR-Miksaĵproduktoj povas esti rekte elektroforeitaj post PCR, sen aldono de provaĵbufro.

Kato. Ne Pakanta Grandeco
4992780 1ml
4992781 5 * 1ml
4992782 1ml
4992906 5 * 1ml

Produkta Detalo

Laborfluo

Oftaj Demandoj

Produktaj Etikedoj

Aktiva Difino

La agado de 1-unuo (U) Pfu-DNA-Polimerazo estas difinita kiel la kvanto de enzimo necesa por enkorpigi 10 nmol-deoksinukleotidojn en acid-nesolveblajn substancojn je 74 ° C ene de 30-min uzante aktivigitan salman sperm-DNA kiel ŝablonon / enkondukon.

Kontrolo de kvalito

La pureco per SDS-PAGE-detekto estas pli ol 99%; Neniu agado de eksogena nucleaso estas detektita; Unu-kopia geno en homa genaro povus efike plifortiĝi; Neniu signifa agado ŝanĝiĝas se konservita ĉe ĉambra temperaturo dum unu semajno.

Ĉefaj Teknikaj Parametroj

Ĝi havas 3′-5 ′ -eksonukleanan agadon kaj neniun 5′-3 ′ -eksonucleanan agadon. La etenda rapido de DNA-plifortigo estas pli malalta ol tiu de Taq-polimerazo, kaj ĝenerale la etenda rapido de Pfu-enzimo estas 0,5-1 kb po minuto. La termika stabileco de Pfu estas pli bona ol Taq. Por ŝablonoj kun alta GC-enhavo, la denaturiga temperaturo povas esti pliigita ĝis 98 ° C, kio ne efikas sur la agado de Pfu-polimerazo. La PCR-produkto estas malakra-finita, kiu povas esti aldonita kun 3'-dA-superpendaĵoj antaŭ ligita kun TA-vektoro aŭ klonita kun malakra-finita vektoro

Aplikoj

Ĝi povas esti uzita por altfidela plifortigo de DNA, kiel ekzemple genekspresio klonado, ejo-direktita mutacio, ununura nukleotida polimorfismo (SNP) analizo kaj finriparado.

Ĉiuj produktoj povas esti personecigitaj por ODM / OEM. Por detaloj,bonvolu alklaki Agorditan Servon (ODM / OEM)


  • Antaŭa:
  • Sekva:

  • product_certificate04 product_certificate01 product_certificate03 product_certificate02
    ×
    Experimental ExampleExperimental Example Uzu genomic-DNA kiel ŝablonon por plifortigi 1kb-fragmenton.
    Post la PCR-reago, prenu 5 μl por elektroforeza detekto.
    Q: Neniuj plifortigaj bandoj

    A-1-Ŝablono

    ■ La ŝablono enhavas proteinajn malpuraĵojn aŭ inhibitorojn de Taq, ktp. ——Purigi DNA-ŝablonon, forigi proteinajn malpuraĵojn aŭ ĉerpi ŝablonan DNA per purigaj ilaroj.

    ■ La denaturigo de ŝablono ne estas kompleta —— Taŭge pliigi denaturigan temperaturon kaj plilongigi denaturigan tempon.

    ■ Ŝablona degradado ——Re-preparu la ŝablonon.

    A-2-Enkonduko

    ■ Malbona kvalito de enkondukoj ——Re-sintezi la enkondukon.

    ■ Unua degradado ——Aliquot la altaj koncentriĝaj enkondukoj en malgrandan volumon por konservado. Evitu multoblajn frostojn kaj degelojn aŭ longdaŭrajn 4 ° C kriokonservitajn.

    ■ Nedeca projektado de enkondukoj (ekz. Enkonduka longo ne sufiĉas, dimero formiĝis inter enkondukoj, ktp.) -Resinaj enkondukoj (evitu formadon de enkonduka dimero kaj duaranga strukturo)

    A-3 Mg2+koncentriĝo

    ■ Mg2+ koncentriĝo estas tro malalta ——Propre pliigi Mg2+ koncentriĝo: Optimumigi la Mg2+ koncentriĝo per serio de reagoj de 1 mM ĝis 3 mM kun intervalo de 0,5 mM por determini la optimuman Mg2+ koncentriĝo por ĉiu ŝablono kaj enkonduko.

    A-4-temperado

    ■ La alta temperateco influas la ligadon de enkonduko kaj ŝablono. —— Redukti la kalcinan temperaturon kaj optimumigi la staton kun gradiento de 2 ° C.

    A-5 Plilongiga tempo

    ■ Mallonga plilongiga tempo —— Pliigi plilongigan tempon.

    Q: Falsa pozitiva

    Fenomenoj: Negativaj specimenoj ankaŭ montras la celajn sekvencajn bandojn.

    A-1-Poluado de PCR

    ■ Krucpoluado de celsekvenco aŭ plifortigaj produktoj ——Zorge ne pipeti la specimenon enhavantan celsekvencon en la negativa specimeno aŭ elverŝi ilin el la centrifuga tubo. La reakciiloj aŭ ekipaĵoj devas esti aŭtoklavitaj por forigi ekzistantajn nukleajn acidojn, kaj la ekzisto de poluado devas esti determinita per negativaj kontrolaj eksperimentoj.

    ■ Reakcia poluado ——Aliquot la reakciiloj kaj konservu al malalta temperaturo.

    A-2-Primor

    ■ Mg2+ koncentriĝo estas tro malalta ——Propre pliigi Mg2+ koncentriĝo: Optimumigi la Mg2+ koncentriĝo per serio de reagoj de 1 mM ĝis 3 mM kun intervalo de 0,5 mM por determini la optimuman Mg2+ koncentriĝo por ĉiu ŝablono kaj enkonduko.

    ■ Nedeca projekcio de enkonduko, kaj la cela sekvenco havas homologion kun la ne-cela sekvenco. ——Re-projektaj enkondukoj.

    Q: Nespecifa plifortigo

    Fenomenoj: La PCR-amplifaj grupoj ne kongruas kun la atendata grandeco, ĉu granda ĉu malgranda, ĉu foje okazas ambaŭ specifaj amplifaj bandoj kaj nespecifaj amplifaj bandoj.

    A-1-Enkonduko

    ■ Malbona primara specifaĵo

    ——Re-projekta enkonduko.

    ■ La enkonduka koncentriĝo estas tro alta ——Proponu pliigi la denaturigan temperaturon kaj plilongigi la denaturigan tempon.

    A-2 Mg2+ koncentriĝo

    ■ La Mg2+ koncentriĝo estas tro alta ——Propre reduktu la koncentriĝon de Mg2 +: Optimumigu la Mg2+ koncentriĝo per serio de reagoj de 1 mM ĝis 3 mM kun intervalo de 0,5 mM por determini la optimuman Mg2+ koncentriĝo por ĉiu ŝablono kaj enkonduko.

    A-3 Thermostable polimerazo

    ■ Troa enzima kvanto ——Redukti enziman kvanton taŭge laŭ intertempoj de 0,5 U.

    A-4-temperado

    ■ La kaluma temperaturo estas tro malalta —— Taŭge pliigu la kalcinan temperaturon aŭ alprenu la dufazan kalcinan metodon

    A-5-PCR-cikloj

    ■ Tro multaj PCR-cikloj —— Redukti la nombron de PCR-cikloj.

    P: Flikaj aŭ makulaj bandoj

    A-1-Enkonduko——Malbona specifeco ——Re-projektu la enkondukon, ŝanĝu la pozicion kaj longon de la enkonduko por plibonigi ĝian specifecon; aŭ plenumu nestitan PCR.

    A-2-Ŝablona DNA

    ——La ŝablono ne estas pura ——Purigu la ŝablonon aŭ ĉerpu DNA per purigiloj.

    A-3 Mg2+ koncentriĝo

    ——Mg2+ koncentriĝo estas tro alta ——Vere reduktu Mg2+ koncentriĝo: Optimumigi la Mg2+ koncentriĝo per serio de reagoj de 1 mM ĝis 3 mM kun intervalo de 0,5 mM por determini la optimuman Mg2+ koncentriĝo por ĉiu ŝablono kaj enkonduko.

    A-4 dNTP

    ——La koncentriĝo de dNTP estas tro alta ——Reduktu la koncentriĝon de dNTP konvene

    A-5 Rekvanta temperaturo

    ——Tre malalta temperatura temperado ——Tone plialtiĝu la temperaturo de la temperado

    A-6-Cikloj

    —— Tro multaj cikloj ——Optimigu la ciklan numeron

    Q: Kiom da ŝablona DNA aldoniĝu en 50 μl-PCR-reaga sistemo?
    ytry
    Q: Kiel plifortigi longajn fragmentojn?

    La unua paŝo estas elekti la taŭgan polimerazon. Regula Taq-polimerazo ne povas provlegi pro manko de 3'-5'-eksonuclease-agado, kaj misagordo multe reduktos la etendaĵefikecon de fragmentoj. Tial regula Taq-polimerazo ne povas efike plifortigi celajn fragmentojn pli grandajn ol 5 kb. Taq-polimerazo kun speciala modifo aŭ alia altfidela polimerazo devas esti elektita por plibonigi etendan efikecon kaj plenumi la bezonojn de longa fragmenta plifortigo. Krome, la plifortigo de longaj fragmentoj ankaŭ postulas respondan ĝustigon de enkonduka projektado, denaturiga tempo, plilongiga tempo, bufra pH, ktp. Kutime, enkondukoj kun 18-24 bp povas konduki al pli bona rendimento. Por malebligi ŝablonan damaĝon, la denaturiga tempo je 94 ° C reduktiĝu al 30 sek aŭ malpli po ciklo, kaj la tempo por levi temperaturon ĝis 94 ° C antaŭ ol plifortigo estu malpli ol 1 min. Cetere, agordi la etendan temperaturon je ĉirkaŭ 68 ° C kaj projekti la etendan tempon laŭ la rapideco de 1 kb / min povas certigi efikan plifortigon de longaj fragmentoj.

    Q: Kiel plibonigi la plifortigan fidelecon de PCR?

    La erarofteco de PCR-plifortigo povas esti reduktita uzante diversajn DNA-polimerazojn kun alta fideleco. Inter ĉiuj ĝisnunaj Taq-DNA-polimerazoj trovitaj, Pfu-enzimo havas la plej malaltan eraroftecon kaj la plej altan fidelecon (vidu ĉemetitan tabelon). Aldone al enzimelekto, esploristoj povas plu redukti PCR-mutacioftecon optimumigante reagokondiĉojn, inkluzive de optimumigado de bufrokunmetaĵo, koncentriĝo de termostabila polimerazo kaj optimumigado de PCR-ciklonombro.

    Skribu vian mesaĝon ĉi tie kaj sendu ĝin al ni