Rapida Ejo-Direktita Mutagenesis-Ilaro

A-1-Ŝablono

■ La ŝablono enhavas proteinajn malpuraĵojn aŭ inhibitorojn de Taq, ktp. ——Purigi DNA-ŝablonon, forigi proteinajn malpuraĵojn aŭ ĉerpi ŝablonan DNA per purigaj ilaroj.

■ La denaturigo de ŝablono ne estas kompleta —— Taŭge pliigi denaturigan temperaturon kaj plilongigi denaturigan tempon.

■ Ŝablona degradado ——Re-preparu la ŝablonon.

A-2-Enkonduko

■ Malbona kvalito de enkondukoj ——Re-sintezi la enkondukon.

■ Unua degradado ——Aliquot la altaj koncentriĝaj enkondukoj en malgrandan volumon por konservado. Evitu multoblajn frostojn kaj degelojn aŭ longdaŭrajn 4 ° C kriokonservitajn.

■ Nedeca projektado de enkondukoj (ekz. Enkonduka longo ne sufiĉas, dimero formiĝis inter enkondukoj, ktp.) -Resinaj enkondukoj (evitu formadon de enkonduka dimero kaj duaranga strukturo)

A-3 Mg²⁺koncentriĝo

■ Mg²⁺ koncentriĝo estas tro malalta ——Propre pliigi Mg²⁺ koncentriĝo: Optimumigi la Mg²⁺ koncentriĝo per serio de reagoj de 1 mM ĝis 3 mM kun intervalo de 0,5 mM por determini la optimuman Mg²⁺ koncentriĝo por ĉiu ŝablono kaj enkonduko.

A-4-temperado

■ La alta temperateco influas la ligadon de enkonduko kaj ŝablono. —— Redukti la kalcinan temperaturon kaj optimumigi la staton kun gradiento de 2 ° C.

A-5 Plilongiga tempo

■ Mallonga plilongiga tempo —— Pliigi plilongigan tempon.

Fenomenoj: Negativaj specimenoj ankaŭ montras la celajn sekvencajn bandojn.

A-1-Poluado de PCR

■ Krucpoluado de celsekvenco aŭ plifortigaj produktoj ——Zorge ne pipeti la specimenon enhavantan celsekvencon en la negativa specimeno aŭ elverŝi ilin el la centrifuga tubo. La reakciiloj aŭ ekipaĵoj devas esti aŭtoklavitaj por forigi ekzistantajn nukleajn acidojn, kaj la ekzisto de poluado devas esti determinita per negativaj kontrolaj eksperimentoj.

■ Reakcia poluado ——Aliquot la reakciiloj kaj konservu al malalta temperaturo.

A-2-Primor

■ Mg²⁺ koncentriĝo estas tro malalta ——Propre pliigi Mg²⁺ koncentriĝo: Optimumigi la Mg²⁺ koncentriĝo per serio de reagoj de 1 mM ĝis 3 mM kun intervalo de 0,5 mM por determini la optimuman Mg²⁺ koncentriĝo por ĉiu ŝablono kaj enkonduko.

■ Nedeca projekcio de enkonduko, kaj la cela sekvenco havas homologion kun la ne-cela sekvenco. ——Re-projektaj enkondukoj.

Fenomenoj: La PCR-amplifaj grupoj ne kongruas kun la atendata grandeco, ĉu granda ĉu malgranda, ĉu foje okazas ambaŭ specifaj amplifaj bandoj kaj nespecifaj amplifaj bandoj.

A-1-Enkonduko

■ Malbona primara specifaĵo

——Re-projekta enkonduko.

■ La enkonduka koncentriĝo estas tro alta ——Proponu pliigi la denaturigan temperaturon kaj plilongigi la denaturigan tempon.

A-2 Mg²⁺ koncentriĝo

■ La Mg²⁺ koncentriĝo estas tro alta ——Propre reduktu la koncentriĝon de Mg2 +: Optimumigu la Mg²⁺ koncentriĝo per serio de reagoj de 1 mM ĝis 3 mM kun intervalo de 0,5 mM por determini la optimuman Mg²⁺ koncentriĝo por ĉiu ŝablono kaj enkonduko.

A-3 Thermostable polimerazo

■ Troa enzima kvanto ——Redukti enziman kvanton taŭge laŭ intertempoj de 0,5 U.

A-4-temperado

■ La kaluma temperaturo estas tro malalta —— Taŭge pliigu la kalcinan temperaturon aŭ alprenu la dufazan kalcinan metodon

A-5-PCR-cikloj

■ Tro multaj PCR-cikloj —— Redukti la nombron de PCR-cikloj.

A-1-Enkonduko——Malbona specifeco ——Re-projektu la enkondukon, ŝanĝu la pozicion kaj longon de la enkonduko por plibonigi ĝian specifecon; aŭ plenumu nestitan PCR.

A-2-Ŝablona DNA

——La ŝablono ne estas pura ——Purigu la ŝablonon aŭ ĉerpu DNA per purigiloj.

A-3 Mg²⁺ koncentriĝo

——Mg²⁺ koncentriĝo estas tro alta ——Vere reduktu Mg²⁺ koncentriĝo: Optimumigi la Mg²⁺ koncentriĝo per serio de reagoj de 1 mM ĝis 3 mM kun intervalo de 0,5 mM por determini la optimuman Mg²⁺ koncentriĝo por ĉiu ŝablono kaj enkonduko.

A-4 dNTP

——La koncentriĝo de dNTP estas tro alta ——Reduktu la koncentriĝon de dNTP konvene

A-5 Rekvanta temperaturo

——Tre malalta temperatura temperado ——Tone plialtiĝu la temperaturo de la temperado

A-6-Cikloj

—— Tro multaj cikloj ——Optimigu la ciklan numeron

La unua paŝo estas elekti la taŭgan polimerazon. Regula Taq-polimerazo ne povas provlegi pro manko de 3'-5'-eksonuclease-agado, kaj misagordo multe reduktos la etendaĵefikecon de fragmentoj. Tial regula Taq-polimerazo ne povas efike plifortigi celajn fragmentojn pli grandajn ol 5 kb. Taq-polimerazo kun speciala modifo aŭ alia altfidela polimerazo devas esti elektita por plibonigi etendan efikecon kaj plenumi la bezonojn de longa fragmenta plifortigo. Krome, la plifortigo de longaj fragmentoj ankaŭ postulas respondan ĝustigon de enkonduka projektado, denaturiga tempo, plilongiga tempo, bufra pH, ktp. Kutime, enkondukoj kun 18-24 bp povas konduki al pli bona rendimento. Por malebligi ŝablonan damaĝon, la denaturiga tempo je 94 ° C reduktiĝu al 30 sek aŭ malpli po ciklo, kaj la tempo por levi temperaturon ĝis 94 ° C antaŭ ol plifortigo estu malpli ol 1 min. Cetere, agordi la etendan temperaturon je ĉirkaŭ 68 ° C kaj projekti la etendan tempon laŭ la rapideco de 1 kb / min povas certigi efikan plifortigon de longaj fragmentoj.

La erarofteco de PCR-plifortigo povas esti reduktita uzante diversajn DNA-polimerazojn kun alta fideleco. Inter ĉiuj ĝisnunaj Taq-DNA-polimerazoj trovitaj, Pfu-enzimo havas la plej malaltan eraroftecon kaj la plej altan fidelecon (vidu ĉemetitan tabelon). Aldone al enzimelekto, esploristoj povas plu redukti PCR-mutacioftecon optimumigante reagokondiĉojn, inkluzive de optimumigado de bufrokunmetaĵo, koncentriĝo de termostabila polimerazo kaj optimumigado de PCR-ciklonombro.